ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι φασματοσκοπίες Raman (Frushour and Koenig, 1975; Iconomidou et al., 2000; Spiro and Gaber, 1977; Yu, 1977) και IR (Haris and Chapman, 1995; Iconomidou et al., 2001; Jackson and Mantsch, 1995) είναι φασματοσκοπίες ταλάντωσης. Τα φάσματα Raman και IR δίνουν λεπτομερείς πληροφορίες για τις μοριακές ταλαντώσεις, επειδή δε, αυτές οι ταλαντώσεις είναι ευαίσθητες σε χημικές αλλαγές, τα φάσματα ταλάντωσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την περιγραφή της μοριακής χημείας. Ουσιαστικά, οι ίδιες ταλάντωσεις που δημιουργούν τις "ταινίες" στα φάσματα Raman δημιουργούν και τις "ταινίες" (μέγιστα απορρόφησης) στα φάσματα υπερερύθρου. Ισχύουν όμως συγκεκριμένοι κανόνες "επιλογής", με αποτέλεσμα, το ποιές ταινίες θα εμφανιστούν στα αντίστοιχα φάσματα, να προκύπτει ως συνέπεια των κανόνων αυτών.

Το φαινόμενο Raman είναι φασματοκοπία εκπομπής, κατά την οποία η αλληλεπίδραση μεταξύ φωτονίων και μορίων γίνεται σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα και οι ταινίες του φάσματος Raman αντιστοιχούν σε φωτόνια, τα οποία "σκεδάζονται" ανελαστικά από τα μόρια. Αντιθέτα, οι "ταινίες" του φάσματος υπερερύθρου (IR) οφείλονται σε φωτόνια, τα οποία απορροφώνται από τα μόρια, προκαλώντας μεταπτώσεις από μία ενεργειακή στάθμη ταλάντωσης σε μία άλλη.

Συμπερασματικά, πρέπει να τονιστεί ότι για την πλήρη περιγραφή των ταλαντώσεων ενός μορίου είναι απαραίτητη τόσο η φασματοσκοπία Raman όσο και η φασματοσκοπία υπερερύθρου.

ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Θα σας δωθούν 2 φάσματα πάνω στο Desktop, ένα φάσμα Raman με το όνομα RAMAN.DAT και ένα φάσμα ΙR (υπερερύθρου) με το όνομα ΙR.DAT, τα οποία θα πρέπει να επεξεργαστείτε, δηλ. να τα αναλύσετε και να ερμηνεύσετε την πληροφορία που παίρνετε από αυτά.

Ανοίγουμε τον Η/Υ και με το ποντίκι ακολουθούμε το εξής μονοπάτι:

Aνοίγοντας το πρόγραμμα, στην οθόνη μας εμφανίζεται ένας πίνακας, ο οποίος ονομάζεται DATA1, με δύο στήλες Α(Χ) και Β(Υ) στις οποίες θα εισάγουμε τα δεδομένα μας.

Δηλαδή, στην Α(Χ) θα εισάγουμε τους κυματάριθμους ή Wavenumbers (σε cm-1) και στην Β(Υ) την ένταση Raman ή Raman Intensity για τη φασματοσκοπία FT-Raman και A (Απορροφητικότητα ή Αbsorbance) για τη φασματοσκοπία υπερερύθρου (IR) αντίστοιχα. Για την εισαγωγή των δεδομένων ακολουθούμε το εξής μονοπάτι :

Π.χ.

Αν το αρχείο μας ήταν στο Desktop και λεγόταν FASMA.DAT, θα επιλέγαμε τον κατάλογο Desktop και στο όνομα αρχείου θα γράφαμε FASMA.DAT. Tελειώνοντας θα πατάγαμε OPEN.

Αφού εισάγουμε τα αριθμητικά δεδομένα μας στο πρόγραμμα κάνουμε τη γραφική αναπαράσταση του φάσματος (Plot) :

Στο παράθυρο που ανοίγει στην οθόνη, γίνεται η εισαγωγή των δεδομένων από το Data1 σε ένα σύστημα αξόνων Χ και Y, όπου :

Χ : οι κυματάριθμοι της στήλης Α(Χ) του Data1

Υ : οι τιμές της έντασης Raman ή της απορροφητικότητας Α της στήλης Β(Υ) του Data1.

Αρα, επιλέγοντας την στήλη Α(Χ) του Data1 και πατώντας δεξιά της <-->Χ, όλα τα δεδομένα της στήλης Α(Χ) θα περάσουν στον άξονα Χ. Το ίδιο γίνεται και με τα δεδομένα Β(Υ), πατώντας δεξιά τους <-->Υ .

Τελειώνοντας, πατάμε ΟΚ, ώστε να εμφανιστεί στην οθόνη μας το γράφημα με το φάσμα μας, Graph1.

Επειδή τα δεδομένα μας είναι για μεγαλύτερο εύρος κυματαρίθμων (0-3500 cm-1) απο την περιοχή που παίρνουμε πληροφορίες για τις πρωτείνες, με τις μεθοδολογίες των φασματοσκοπιών Raman (400-1800 cm-1 ) και ΙR (1100-1800 cm-1), θα τροποποιήσουμε τους άξονες Χ και Υ κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να μας δίνουν μόνο την περιοχή του φάσματος που μας ενδιαφέρει.

Αν το φάσμα που έχετε να αναλύσετε είναι φάσμα Raman, τότε :

Στον πίνακα με τις επιλογές για τον άξονα Χ που έχει ανοίξει μπροστά σας θα πάτε στο κομμάτι που αφορά το Scale και θα καθορίσετε στα κουτάκια που γράφουν From και To, από ποιόν κυματάριθμο αρχίζει το φάσμα σας και σε ποιόν τελιώνει.

Δηλ.

From: 400

To: 1800

Και στην επιλογή του Ιncrement γράφετε 200.

Τέλος πατάτε ΟΚ.

Το ίδιο θα κάνετε και για τον άξονα Υ, δηλ. στο Scale θα επιλέξετε τιμές From και To που θα είναι κοντά σ΄αυτές που αρχίζει και τελειώνει το φάσμα σας (αυτό θα πρέπει να το βρείτε μόνοι σας δοκιμάζοντας διάφορες τιμές εύρους έντασης, γιατί δεν μπορούμε εκ των προτέρων να ξέρουμε τις τιμές της).

Όταν τελειώσετε με τις αναπροσαρμογές των αξόνων Χ και Υ σώζετε το φάσμα σας με το όνομα που ήδη έχει :

Στην τελευταία φάση της ανάλυσης, με τη χρήση της παλλέτας εργαλείων ή Tools μπορείτε να βρείτε τις κορυφές των ταινιών του φάσματος και να τις αποδώσετε σε συγκεκριμένες χαρακτηριστικές ταλαντώσεις.

Δηλ., με τη χρήση του εργαλείου + το οποίο επιλέγετε με το ποντίκι και το τοποθετείτε πάνω στο φάσμα, ώστε να γίνει κόκκινο σταυρουδάκι (+), περπατάτε πάνω στο φάσμα με τα βελάκια <-- και --> του πληκτρολογίου. Στις κορυφές κάθε ταινίας σημειώνετε τον αντίστοιχο κυματάριθμο. Αυτό γίνεται με τη χρήση του εργαλείου Τ. Επιλέγοντας το εργαλείο Τ, πατάτε με το ποντίκι μέσα στο φάσμα και γράφετε στο πλαίσιο που σας ανοίγει, τον κυματάριθμο κάθε κορυφής των ταινιών του φάσματος, αφού προηγουμένως τον φορμάρετε κατάλληλα, π.χ. rotate: 90 μοίρες , με τις επιλογές που σας δίνονται.

Τις τιμές των κυμματαρίθμων περπατώντας πάνω στο φάσμα, τις βλέπετε στην γκρίζα μπάρα ακριβώς πάνω από το φάσμα (x= cm-1), καθώς και τις εντάσεις Raman (ή απορροφητικότητας ΙR) (y= cm-1), στις οποίες αντιστοιχούν.

Για να αποφασίσετε σε ποιόν ακριβώς κυματάριθμο αντιστοιχούν τα μέγιστα των ταινιών, παρατηρείτε ταυτόχρονα τις τιμές των εντάσεων Raman (ή απορροφητικότητας IR), ώστε να είναι κι αυτές μέγιστες.

Αφού τελειώσετε με την ανάλυση του φάσματος και βρείτε όλα τα μέγιστα των ταινιών, θα πρέπει με γνωστούς πίνακες από την βιβλιογραφία να τις αποδώσετε σε συγκεκριμένες χαρακτηριστικές ταλαντώσεις.

Δηλαδή, να ερμηνεύσετε σε ποιές ταλαντώσεις οφείλονται, με ιδιαίτερη προσοχή στις περιοχές των αμιδικών ταινιών Ι, ΙΙ και ΙΙΙ, που είναι χαρακτηριστικές για πρωτεΐνες.

Θα πρέπει (με τη βοήθεια των πινάκων Ι, ΙΙ και ΙΙΙ):

1. Nα καταλήξετε σε συμπεράσματα σχετικά με τον τύπο της δευτεροταγούς δομής στον οποίο ανήκει η υπό μελέτη πρωτείνη.

2. Να αναγνωρίσετε ταινίες που οφείλονται σε συγκεκριμένους τύπους αμινοξικών καταλοίπων (κυρίως αρωματικών).

ANAΦΟΡΕΣ

1. Frushour, B.J., Koenig, J.L. (1975) Raman Spectroscopy of proteins, in Clark, R.J.H., and Hester, R.E. (Eds.), Advances in Infrared and Raman Spectroscopy, Vol 1, pp. 35-97, Heyden London.

2. Haris, P.I., Chapman, D. (1995) The conformational analysis of peptides using Fourier transform IR spectroscopy. Biopolymers (Peptide Sci.) 37, 251–263.

3. Iconomidou, V.A., Chryssikos, G.D., Gionis, V., Pavlidis, M.A., Paipetis, A. and Hamodrakas, S.J. (2000) Secondary structure of chorion proteins of the teleostean fish Dentex dentex by ATR FT-IR and FT-Raman spectroscopy J Struct Biol, 132, 112-122

4. Iconomidou, V.A., Chryssikos, G.D., Gionis, V., Willis J.H. and Hamodrakas, S.J. (2001) "Soft"-cuticle protein secondary structure as revealed by FT-Raman, ATR FT-IR and CD spectroscopy, Insect Biochem. Molec. Biol., 31, 877-855.

5. Jackson, M., Mantsch, H.H. (1995) The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30 (2), 95–120.

6. Spiro, T.G., Gaber, B.P. (1977) Laser-Raman scattering as a probe of protein structure. Annu. Rev. Biochem. 46, 553-572.

7. Yu, N.T. (1977) Raman Spectroscopy: A conformational probe in Biochemistry. CRC Crit. Rev. Biochem. 4, 229-280.

ΠΙΝΑΚΑΣ Ι

Διαγνωστικές αμιδικές ταινίες φάσματος Raman :

ΠΙΝΑΚΑΣ ΙI

Διαγνωστικές αμιδικές ταινίες φάσματος υπερερύθρου (IR) :

ΠΙΝΑΚΑΣ ΙII

Κυματάριθμοι και αποδόσεις χαρακτηριστικών ταινιών φάσματος Raman: